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上海晶抗生物猴Ⅲ型前膠原肽P亞NP(PⅢNP)ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法，通過抗原 - 抗體特異性結(jié)合與酶促顯色反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)猴樣本中 PⅢNP 的定量檢測(cè)。

一、核心原理總覽

試劑盒微孔板預(yù)先包被PⅢNP捕獲抗體。樣本 / 標(biāo)準(zhǔn)品中的PⅢNP與捕獲抗體結(jié)合，再與HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體形成 “捕獲抗體-PⅢNP-酶標(biāo)檢測(cè)抗體" 夾心復(fù)合物。洗去未結(jié)合物后，加入 TMB底物顯色，顏色深淺與PⅢNP濃度正相關(guān)。酶標(biāo)儀測(cè)450nm吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中PⅢNP含量。

二、詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟與原理

固相包被：酶標(biāo)板微孔已預(yù)包被高特異性抗猴PⅢNP捕獲抗體，通過物理吸附 / 化學(xué)偶聯(lián)固定于固相表面，形成捕獲相。

加樣與孵育

標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入系列濃度PⅢNP標(biāo)準(zhǔn)品（如 5000、2500、1250、625、312.5、156.25 pg/mL）。

樣本孔：加入待測(cè)樣本（血清、血漿、組織勻漿等）。

所有孔（空白除外）加入HRP標(biāo)記的PⅢNP檢測(cè)抗體，37℃孵60分鐘。樣本 / 標(biāo)準(zhǔn)品中PⅢNP 同時(shí)與固相捕獲抗體、液相酶標(biāo)檢測(cè)抗體結(jié)合，形成夾心免疫復(fù)合物。

洗板：充分洗滌5次，去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體及雜質(zhì)，降低非特異性背景。

底物顯色：加入TMB底物A、B，37℃避光孵育15分鐘。HRP催化TMB由無色變?yōu)樗{(lán)色，顯色強(qiáng)度與復(fù)合物中HRP量（即PⅢNP量）成正比。

終止反應(yīng)：加入終止液，藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，終止酶促反應(yīng)。

檢測(cè)與定量：酶標(biāo)儀測(cè) 450nm OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本 OD 值代入曲線，計(jì)算 PⅢNP濃度。

三、關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)

特異性：雙抗體識(shí)別PⅢNP不同表位，確保僅結(jié)合目標(biāo)分子，減少交叉反應(yīng)。

靈敏度：HRP 酶促放大信號(hào)，可檢測(cè)低至 pg/mL 級(jí) PⅢNP。

定量依據(jù)：OD 值與 PⅢNP 濃度在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
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