western blot的試驗過程及注意事項的材料
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳搬運到硝酸纖維膜上。
1）搬運緩沖液洗刷凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回翻滾去除一切的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用搬運緩沖液浸濕），將凝膠夾在中心，堅持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙依照廠家主張辦法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿搬運緩沖液以吞沒凝膠。
5）依照廠家所示接通電源開端電泳搬運。
6）搬運完畢后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量規(guī)范閃現時取出，記載下規(guī)范方位。
3. 用100ml水洗刷纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗刷薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下搖擺2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗刷薄膜，每次75ml。
10． 將銜接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內，于室溫下搖擺1小時。
11． 按過程9洗刷。
12． 參加抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下搖擺。
注意事項：
western blot中搬運在膜上的蛋白處于變性狀況，空間結構改動，因而那些辨認空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況能夠將表達意圖蛋白的細胞或細胞裂解液中的一切蛋白物素化，再用酶符號親和素進行western blot。試驗中取膠和膜需帶手套。
