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ELISA穩(wěn)定方法
更新時(shí)間:2015-06-30   點(diǎn)擊次數(shù):1240次

ELISA檢測系統(tǒng)可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研出產(chǎn)中zui為敏捷的技術(shù)手段。自己也為此苦惱過很長一段時(shí)間,跟著自己技術(shù)水平得進(jìn)步,或多或少地也把握了ELISA體系的脾氣,也是熟能生巧吧,現(xiàn)在做方陣,做ELISA已是輕車熟路了,以前檢測一種抗體用整整一下戰(zhàn)書還算得暈暈的,現(xiàn)在給我十個(gè)八個(gè)的從包被到顯色,一個(gè)工作日基本搞定??墒窃谛吕鲜植倏v過程中老是會(huì)泛起或大或小的題目,本人在剛開始做ELISA時(shí)就面對良多災(zāi)題,固然有師兄師姐鋪路,但仍是經(jīng)常做得烏煙瘴氣,好比說花板,假陽性,全顯色,全部顯色,顯色比空缺還低。
     常用封鎖劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉,可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。詳細(xì)的試驗(yàn)還要有堅(jiān)固的理論外也要實(shí)踐,看一下*可不可以應(yīng)用到自己試驗(yàn)當(dāng)中去。但*選用什么,要依據(jù)試驗(yàn)詳細(xì)來實(shí)踐。應(yīng)留意以下原理:因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用,這種物理吸附長短特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán),故更易吸附到固相載體表面。小分子必需依賴和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。還有有的包被原可能不是蛋白,對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被,親和素生物素:先親和素先包被載體,加入生物素化的DNA,這種包被方法平均、牢固,已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
     包被原的性質(zhì)很重要,蛋白濃度,是否降解,這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別,所以保留抗原很重要,我做重組蛋白時(shí),師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個(gè)道理。封鎖就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地空閑,從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。但有時(shí)因?yàn)樵囼?yàn)的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。

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